工程化Treg細胞調控機體免疫耐受及其生物醫學應用

摘    要：調節性T細胞（Tregs）是一類機體發揮免疫調節功能的T淋巴細胞亞群，能夠高效、安全、可控的調節機體免疫，在自身免疫疾病及器官移植術后免疫排斥等炎癥疾病的治療應用中發揮關鍵作用。然而，治療脫靶和功能表型不穩定給Tregs的臨床應用帶來巨大挑戰。生物醫學工程改造策略不僅能夠促進Tregs主動靶向與炎癥趨化，還可維持Tregs叉頭盒蛋白p3（Foxp3）蛋白在炎癥環境中的表達穩定性，持續發揮機體免疫調節功能。本文詳述Tregs的免疫調節機制，并對生物醫學工程化改造的Tregs在自身免疫疾病、器官移植等炎癥疾病中的應用進行了展望，旨在啟發和促進Tregs免疫過繼療法的臨床應用研究。

關鍵詞:調節性T細胞;過繼性細胞免疫治療;免疫調節;自身免疫疾病;兔疫排斥;

Engineered Treg Cells Regulate Immune Tolerance for Biomedical Applications Biological

and material engineering strategies to empower Tregs immunotherapy

ZHENG Si-Rui LIAO Jian-Hong CHEN Ze PAN Hong HUANG Zun-Nan ZHENG Ming-Bin

CAI Lin-Tao

School of Pharmacy, Key Laboratory of Computer-Aided Drug Design of Dongguan City,Guangdong

Medical University CAS -HK Joint Lab of Biomaterials, Guangdong Key Laboratory of

Nanomedicine, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences

Institute for Hepatology, National Clinical Research Center for Infectious Disease, Shenzhen Third

People's Hospital

Abstract：Regulatory T cells (Tregs) are T lymphocytes that perform immunomodulatory functions. By providing accurate, efficient, safe and controlled regulation of systemic immunity, Tregs play a key role in the treatment of autoimmune diseases and immune rejection after organ transplantation. However, Tregs have clinical limitations such as off-targeting and functional phenotype instability. Genetic and biomedical engineering are promising strategies to promote Treg active targeting and chemotaxis to the inflammation site, and to maintain Treg Foxp3 (Forkhead box protein 3) expression during immune-regulation. Herein, Treg anti-inflammatory mechanisms, engineering tactics and bulk production methods are systematically summarized. By anti-inflammatory cytokine secretion, Granzyme B release or effector T cell metabolism intervention, Tregs can inhibit effector T cell proliferation and activation, or even kill immune cells. Moreover, expressing genetically modified receptors (CARs, TCRs and CXCRs) or conjugating nanomaterials onto cell surface, can help enhance targeted recognition and maintain anti-inflammatory function of Tregs. Artificial antigen-presenting-cells or costimulatory molecules can stimulate Treg cell proliferation and activation. By prospecting the application of biomedical-engineered Tregs in autoimmune diseases, organ transplantation and other inflammatory diseases, this work aims to inspire and promote the clinical application of Tregs adoptive therapy.

Keyword：regulatory T cell; adoptive immunotherapy; immune tolerance; autoimmune disease; immunological rejection;

調節性T細胞（Tregs）是一類具有顯著免疫抑制功能的CD4+T細胞亞群。Tregs能夠抑制效應T細胞、效應B細胞等免疫應答，誘導機體對抗原的免疫耐受，發揮免疫抑制功能[1]。主要機制包括：Tregs通過分泌抑炎細胞因子，抑制效應細胞增殖活化[2,3,4,5]；Tregs釋放顆粒酶B誘導效應細胞凋亡，發揮細胞毒性作用[6]；Tregs干擾效應細胞代謝，抑制效應細胞增殖和殺傷作用[7]；Tregs抑制樹突狀細胞（DC）成熟活化，阻斷機體抗原呈遞調節自身免疫[8,9,10,11]（圖1）。因此，Tregs在介導免疫細胞增殖與代謝、維持免疫環境穩態中發揮著重要作用。

Tregs作為一類調節免疫細胞功能的T細胞亞群，參與機體免疫穩態調節，目前已應用于多項臨床實驗研究。截至2022年，全球已有超過1100項Tregs臨床試驗，在腎臟或肝臟移植、系統性紅斑狼瘡、炎癥性腸病、自身免疫性肝炎、過敏和哮喘、糖尿病等方面開展Tregs治療研究[12,13]。其中，在Tregs療法治療肝移植患者研究中，輸注Tregs可在移植肝臟中富集，抑制移植肝臟中效應細胞的增殖活化，有效延長移植肝臟存活時間[14]。然而，Tregs由于缺乏自身抗原特異性，難以識別病灶部位抗原靶點和定位至病灶部位，可導致機體免疫系統處于持續的免疫抑制狀態，最終造成多器官累積毒性，增加病原體感染和惡性腫瘤發生風險[15,16,17,18]。此外，Tregs在炎癥環境中的表觀遺傳學特征不穩定，容易引起叉頭盒蛋白p3（Foxp3）蛋白表達缺失，造成免疫調節功能喪失，最終導致臨床試驗失敗[1,19]。因此，開發新型技術促進Treg細胞的增殖、局部富集以及穩定Tregs免疫抑制功能，對于自身免疫疾病、器官移植術后排斥等炎癥疾病臨床治療意義重大。

工程化改造Tregs是實現Tregs數量體外擴增并提高其靶向性和穩定性的關鍵解決策略。目前較為成熟的工程化改造技術分為生物工程化改造技術和材料工程化改造技術：生物工程化改造技術主要通過誘導Tregs高表達組織特異性抗原受體包括T細胞受體、抗原嵌合受體以及趨化因子受體，可促進Tregs對炎癥組織表達的特定抗原（如血友病因子VIII、瓜氨酸波形蛋白）的精準識別并刺激Tregs活化，實現Tregs在靶器官的增殖和駐留，提高Tregs病灶趨向能力，發揮精確的局部免疫調節效果[1]；材料工程化改造技術主要利用生物活性材料構建藥物儲庫，為Tregs生長發育提供良好環境，利于Tregs的體外擴增，同時定點緩釋以穩定Tregs在炎癥環境中的免疫抑制功能。這些工程化改造技術用于增強Tregs的特異性和功能性, 使得自身免疫和移植后免疫排斥的Tregs過繼療法得到快速的發展（圖 2）。

1 病灶靶向

1.1 轉導T細胞受體的Tregs細胞 （TCR-Tregs）療法

TCR-Tregs療法是采用生物工程化改造技術，將抗原特異性TCR導入患者Tregs，進而提高Tregs特異性識別自體或異體抗原的能力，發揮抗原特異性抑制和非特異性旁觀者抑制效應，降低炎癥反應，從而形成局部免疫耐受微環境，因此被廣泛用于自身免疫疾病及器官移植術后免疫排斥的治療[19,20]。髓鞘堿性蛋白是中樞神經系統髓鞘中高表達的自身抗原，基于髓鞘堿性蛋白抗原設計的TCR-Tregs通過TCR識別髓鞘堿性蛋白抗原并靶向髓鞘，TCR識別激活隨后抑制髓鞘堿性蛋白特異性效應T細胞的增殖和活化并分泌抑炎細胞因子，降低髓鞘炎癥反應，有效保護髓鞘結構，最終延緩多發性硬化癥疾病進展（臨床前研究）[19]。谷氨酸脫羧酶是Ⅰ型糖尿病小鼠胰島中效應T細胞膜表面高表達的抗原，針對谷氨酸脫羧酶開發了一種特異性TCR-Tregs，通過識別胰島中谷氨酸脫羧酶抗原靶向Ⅰ型糖尿病小鼠胰島，從而有效抑制胰島中效應T細胞的增殖，保護胰島β細胞功能，有效減少小鼠對外源胰島素的依賴，有效延緩Ⅰ型糖尿病進程（臨床前研究）[20]。TCR-Tregs利用對H-2Kd抗原特異性的TCR-Tregs治療同種異體心臟移植術后免疫排斥，能夠靶向識別異體移植心臟并誘導CD8+T細胞耗竭，減少心內膜增厚，顯著延長異體移植心臟的存活時間（臨床前研究）[21]。綜上所述，TCR工程化的Tregs療法利用TCR識別抗原特性，有效提高Tregs的靶向性，從而極大緩解自身免疫疾病以及器官移植術后排斥。TCR-Tregs療法存在親和力低，依賴效應T細胞分離抗原特異性TCR等挑戰，進而限制其特異性和精準度。因此，需要探索更加精準的TCR-Tregs篩選方法，例如使用單克隆抗體高通量篩選、應用基因編輯技術、合成生物學等技術，提高其識別特異性和治療精準度[1,22]。

1.2 嵌合抗原受體的Tregs細胞（CAR-Tregs）療法

CAR-Tregs療法是利用生物工程技術使Tregs細胞表達靶向炎癥組織抗原的抗原嵌合受體，包括胞外結構域中的抗原結合位點與胞內T細胞的共刺激分子。相較于TCR-Tregs，CAR-Tregs的靶向識別過程不依賴傳統的T細胞受體，通過繞過人類白細胞抗原（HLA）限制來提高CARs的靶向靈活性，因此，CAR-Tregs在自身免疫疾病及器官移植術后免疫排斥中具有優良的治療潛力（圖3）[23,24,25,26,27]。瓜氨酸波形蛋白是一種大量存在于關節炎患者細胞外基質的抗原，針對氨酸波形蛋白開發了一種特異性的CAR-Tregs，CAR-Tregs經靜脈輸注后靶向關節炎患者的關節腔，進而抑制效應T細胞引起的滑膜炎對關節軟骨的破壞和骨侵蝕，達到緩解關節炎和阻斷病程的目的（臨床前研究）[25]。具有識別血友病因子VIII抗原的CAR-Tregs可有效抑制FVIII特異性效應T細胞的增殖和促炎細胞因子產生，并發揮旁觀者效應誘導機體產生免疫耐受，極大改善血友病患者的生存質量（臨床前研究）[26]。靶向HLA-A2抗原的CAR-Tregs能夠在胰島中富集，減輕對異體移植胰島的免疫排斥反應，延長胰島存活時間[27]。靶向黑色素細胞表面標志物神經節苷脂D3（GD3）的CAR-Tregs用于治療白癜風，通過抗原響應分泌大量抑炎細胞因子IL-10，從而更好地抑制對黑色素細胞的效應T細胞毒性，顯著延遲黑色素脫失[28]。

因此，CAR-Tregs具有優異的靶向特性，有助于Tregs靶向病灶部位形成免疫耐受微環境，降低炎癥反應，在炎癥疾病治療方面具有突出優勢。雖然CAR-Tregs已取得一些臨床治療成就，但該療法可能引發細胞因子釋放綜合征（CRS）等嚴重急性毒性，且過度刺激Tregs會導致細胞死亡，無法實現長效的免疫抑制作用。為此，需要通過優化CAR結構，確保CAR-Tregs在輸注后的存活，并評估其安全性。

1.3 轉導趨化因子受體的Tregs細胞（CXCR-Tregs）療法

趨化因子（Chemokine）及趨化因子受體（Chemokine receptor）在介導細胞遷移、增殖過程中發揮重要作用，并與炎癥的發生發展密切相關。研究表明表達趨化因子受體3（CXCR3）的Tregs細胞，可靶向進入多發性硬化癥患者的大腦和Ⅰ型糖尿病患者的胰島，并在病灶處大量富集以發揮局部免疫耐受功能[29,30,31,32]。此外，研究表明預后良好的銀屑病患者皮膚中大量存在表達趨化因子受體4和皮膚淋巴細胞抗原（CLA）的Tregs[29]，因此，Tregs表面高表達趨化因子受體，可促進Tregs特異性靶向至炎癥組織，并在炎癥部位發揮抗原特異性免疫抑制和非特異性旁觀者抑制效應，從而延緩炎癥疾病進展，提高患者生存質量[30]。通過生物工程化改造技術過表達CX3CR受體的CX3CR1-Tregs，可靶向特異性表達CX3CL1的動脈粥樣硬化血管，治療4周后大量CX3CR1-Tregs富集在動脈粥樣硬化血管內壁。CX3CR1-Tregs選擇性歸巢可減緩斑塊進展和減少脂質沉積，同時減少促炎巨噬細胞的浸潤，增加膠原蛋白和平滑肌細胞含量，從而提高斑塊穩定性，顯著延緩動脈粥樣硬化疾病進程（臨床前研究）[31]。此外，在Tregs體外擴增階段，添加雷帕霉素、白介素-2、白介素-12、IFN-γ、rhIL-1β、rhIL-6、rhIL-23、（TNF）-α、維甲酸等促生長因子，可有效促進Tregs細胞的體外擴增效率。其中，添加白介素-2可定向誘導Tregs細胞高表達趨化因子受體7和L-選擇素，有利于Tregs 細胞借助趨化因子受體7響應趨化因子的化學濃度梯度并向外周組織遷移[32]。 高表達趨化因子受體工程化的Tregs特異性靶向病灶部位，為Tregs用于炎癥疾病治療提供了新思路。盡管CXCR-Tregs具有潛在的免疫調節效果，但其療效受限于病灶的趨化因子表達水平及表達特異性。盡管CXCR-Tregs具有潛在的免疫調節效果，但其療效受限于病灶的趨化因子表達水平及表達特異性。因此，有必要進一步研究和篩選適當的趨化因子受體，以提高其治療效果和準確性。在體外擴增過程中，可以通過向培養物中添加細胞因子、代謝物，或通過慢病毒轉染等方式，誘導Tregs高表達趨化因子受體，提高炎癥組織靶向效率，并保持Tregs的功能穩定性。將趨化因子受體與CAR分子或TCR分子結合，將能夠進一步提高Tregs的靶向識別能力，提升精準靶向治療效果，規避脫靶風險[1]（表 1）。

2 功能穩定

材料工程化改造技術為增強Tregs穩定性提供了新的解決途徑。目前研究熱點主要集中于聚合物納米顆粒和水凝膠，因其具有良好藥物載體功能、生物降解后通過旁分泌的作用方式有效遞送生物活性分子至Tregs，有助于Tregs Foxp3蛋白的穩定表達，從而穩定Tregs細胞在炎癥環境中的免疫抑制功能。

2.1 納米材料賦能

聚合物納米顆粒是一類以聚合物為基本骨架, 包載小分子藥物、多肽、蛋白或核酸等物質的一類納米顆粒。聚合物負載于Tregs表面，能夠維持Tregs穩定及活化，有效發揮免疫耐受功能。在聚乳酸-羥基乙酸共聚物-b-聚（乙二醇）馬來酰亞胺聚合物納米顆粒裝載Tregs生長因子IL-2和β細胞再生劑harmine，加入聚-L-賴氨酸（PLL）通過改變聚合物納米顆粒表面電性，促進其與細胞的表面黏附，并且原位緩釋IL-2支持Tregs活化，從而保持Tregs表型穩定和生存能力。（臨床前研究）[33]。聚乳酸-羥基乙酸共聚物聚（β-氨基酯）包封TGF-β，與Tregs結合后持續釋放細胞因子TGF-β，維持了Tregs的去甲基化特征，有效提高Tregs表面CD39和CD73表達量，從而增強了Tregs的穩定性，抑制效應細胞成熟活化（臨床前研究）[34]。聚乳酸-乙醇酸納米顆粒包載IL-2/Fc融合蛋白，通過原位緩釋IL-2并誘導FoxP3轉錄，可促進Tregs免疫調節功能相關的多種基因表達，維持Tregs活性和增殖，最終有效抑制同種異體皮膚移植術后引起的免疫排斥反應，延長了移植皮片存活時間（臨床前研究）[35]。然而，隨著Tregs增殖分裂，用于激活Tregs的納米顆粒和細胞因子的有效濃度會逐漸降低，限制了納米材料工程化Tregs的活體應用。因此，如何延長納米材料在體內的干預時間并維持Tregs的長效性、功能穩定性，是納米材料工程化Tregs面臨的瓶頸問題。亟需通過納米材料的結構與性能優化，使納米材料長效發揮作用，提高Tregs的長期治療效果。

2.2 水凝膠包封

水凝膠在水中能夠充分溶脹而不溶解，是一類具有三維網絡結構的新型功能高分子材料。一方面，水凝膠與機體組織、細胞外基質非常相似，具有調節細胞生長、黏附遷移和分化等能力，極大保留細胞活性。此外，水凝膠具有良好的通透性，水及其水溶性小分子藥物可以在水凝膠內部自由擴散，可維持Tregs細胞免疫抑制功能穩定。另一方面具有良好的生物相容性。為移植細胞在體內增殖分化提供了良好的物理支持，是優良的細胞載體，在器官移植術后免疫排斥治療等領域擁有廣闊的應用前景（圖4）[36]。聚乙二醇-降冰片烯（PEGNB）水凝膠搭載Tregs，可用于Tregs局部遞送并在神經移植部位緩釋（14天）以延長機體免疫耐受時間，浸潤在移植部位的Tregs細胞有效抑制宿主免疫反應，最終用于修復神經節段性損傷、緩解術后免疫排斥并促進受體神經再生（臨床前研究）[37]。利用海藻酸鹽-明膠甲基丙烯酰水凝膠同時封裝白細胞介素-2和趨化因子配體1與Tregs，可維持Tregs的抑制表型并提高免疫抑制功能，此外可趨化體內Tregs進入該結構構建免疫抑制微環境，從而有效抑制胰島移植術后免疫排斥和延長胰島移植物存活時間（臨床前研究）[38]。使用機械強度較高的聚丙烯酰胺水凝膠基質，能夠增強Tregs胞內氧化磷酸化，通過抑制雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路減少葡萄糖攝取促進Tregs表型穩定（臨床前研究）[39]。

因此，水凝膠作為優勢活細胞藥物載體，為細胞增殖和緩釋提供了理想的微環境，可以長期維持Tregs表型功能穩定，為同種異體器官移植術后免疫排斥等治療提供新策略。然而，在復雜的體內環境中，物理交聯型水凝膠會受到外部機械力和組織侵蝕的影響，喪失結構和功能完整性，同時還存在過敏和感染風險，限制了水凝膠活細胞工廠在體內環境中的應用。因此，優選體內生物相容性好、細胞負載能力強的水凝膠至關重要?；诔Щ疨EG基多酰肼交聯劑（HB-PEG-HDZ）和醛化透明質酸（HA-CHO）開發的瞬凝型水凝膠系統，能夠依靠動態鍵的自恢復性能，2小時內即可將分割開的水凝膠自愈整合，為水凝膠包載藥物及其Tregs裝載應用提供了生物相容性和自愈合穩定策略（臨床前研究）[40]。

3 體外擴增

Tregs在維持機體免疫耐受、預防自身免疫病及移植排斥中具有重要作用。但組織中分離獲得的Tregs數量無法滿足臨床需求，限制了其臨床治療應用[41]。因此，迫切需要開發新型體外快速擴增技術滿足Tregs回輸治療劑量，來解決臨床治療研究瓶頸。應用多種人工抗原提呈細胞（aAPC）將HLA-肽復合物及協同刺激分子、黏附分子的抗體或配體偶聯在納米材料載體表面，可有效促進Tregs擴增、分化、募集和遞送，對于Tregs免疫過繼療法具有重要促進作用，并廣泛用于自身免疫病及器官移植術后免疫排斥等炎癥疾病的治療[42]。

aAPC根據所用載體不同，可分為剛性aAPC和非剛性aAPC。其中，剛性載體材料包括磁性微珠、納米管，非剛性載體材料主要為聚合物類納米材料。相較于非剛性載體材料，剛性載體材料形成的空間結構，利于Tregs進入、移動和聚集，從而更利于Tregs的體外擴增。二氧化硅納米管通過沉降和隨機堆積形成的空隙有利于T細胞進入、運動和團聚，同時表面脂質雙分子層結合特定T細胞受體形成人工aAPC，進而提供激活信號促進特定T細胞增殖。聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米顆粒包載IL-2和TGF-β，通過旁分泌方式作用至Tregs，促進Tregs增殖，使Tregs在5天內體外擴增20倍，并表達歸巢受體CD62L和CCR7，回輸至小鼠體內最終延緩系統性紅斑狼瘡疾病的進展（臨床前研究）[43]。相較于非剛性載體材料，剛性載體材料形成的空間結構，利于Tregs進入、移動和聚集，從而更利于Tregs的體外擴增。二氧化硅納米管通過沉降和隨機堆積形成的空隙有利于T細胞進入、運動和團聚，同時表面脂質雙分子層結合特定T細胞受體形成人工aAPC，進而提供激活信號促進特定T細胞增殖。單劑量APC-二氧化硅納米管的，8天擴增了3200倍（臨床前研究）[44]。目前，在Tregs體外擴增方面還存在特異性差、穩定性不佳、活化效率低、轉染效率低等問題。為進一步優化Tregs治療的效果，需要通過設計穩定的aAPC、調整aAPC抗原類型和濃度、改用更高效的轉染手段等方式，提高Tregs活化效率，改善Tregs的臨床應用表現。使用表達CD86抗體的K562細胞作為骨架細胞，并將移植同種抗原（Bw6）特異性的CAR轉導到K562細胞中構建成aAPC，Tregs在aAPC刺激下能夠保留 FoxP3、Helios 和 CAR 的表達，數量擴增 10 倍[45]。

總結

Tregs是一類機體維持免疫穩態功能的T淋巴細胞亞群，利用自身的驅動力和生物學特性穿透多重生理屏障并在病灶部位富集，從而極大程度地提升自身免疫疾病和器官移植術后患者的生活質量。本文綜述了近年來多種基因和材料工程化改造細胞策略用來提高Tregs的靶向性和穩定性，并被應用到自身免疫疾病及器官移植術后排斥等炎癥疾病的臨床治療中。生物工程化改造技術通過賦予Tregs抗原特異性有效提高Tregs的靶向性，減少免疫反應對自體或異體來源組織的損傷。材料工程化改造技術能夠維持Tregs的穩定性，為Tregs生長發育提供良好環境，同時緩釋藥物以穩定Tregs功能。工程化改造策略在Tregs藥物遞送和個體化精準治療等方面具有重大意義，為自身免疫疾病和器官移植術后排斥治療提供了有效解決方案。

雖然生物與材料工程化改造策略在提高Tregs靶向性及維持其功能穩定性方面取得一定進展，但在臨床應用中仍面臨諸多挑戰。針對類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、移植物抗宿主病等自身免疫性疾病和器官移植術后排斥的臨床治療需求，科研人員在從事Tregs的基礎和應用基礎研究中，需要從病灶靶向、功能穩定和體外擴增技術三方面協同入手：1）優化組織特異性抗原受體結構，提升Tregs的病灶靶向和特異識別性能；2）優化生物活性材料的理化性質，結構性能和提高生物安全性，促進Tregs免疫調節功能的長效維持；3）提高Tregs的分選純度，提升Tregs擴增效率，實現Tregs體外擴增技術的標準化和一致性。

為此，可通過以下具體的技術手段優化Tregs功能：1）未來亟需使用單克隆抗體高通量篩選、基因編輯等技術，優化組織特異性抗原受體的分子結構，延長工程化Tregs的細胞壽命并減少脫靶毒性，提高治療效果；2）通過物理包裹或化學改性策略，篩選優化生物活性材料體系，提高Tregs免疫功能的穩定性和治療安全性；3）開展充分的臨床前和臨床研究，系統解析Tregs的活體生物分布、生物安全性和治療應用場景等，加快自身免疫性疾病和器官移植術后排斥等疾病的臨床應用；4）結合磁性細胞分選技術和活細胞分選技術，獲得高純度的Tregs，探索新型培養基與生長因子配比，提高體外擴增Tregs的純度和擴增效率，提高Tregs細胞治療的穩定性和安全性。綜上所述，生物醫學工程化改造技術的整合，使智能Tregs活細胞藥物保護機體免受炎癥侵害的臨床治療目標更近一步。

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